最新の「Know your oligo mod」では、5-methyl deoxycytidineの影響について考察します。この修飾ヌクレオシドは、二重鎖の安定性を高め、治療用オリゴに対する免疫反応を低下させます。
5-methyl deoxycytidine修飾の概要
5-methyl deoxycytidine（5-methyl deoxycytosine, 5-MedCまたは5mdCとも呼ばれる）は、カスタムオリゴヌクレオチドを設計する際にシトシンの置換としてよく用いられます。
5-MedCは、ピリミジン環の5番目の炭素にメチル基を持つメチル化シトシン塩基です。このわずかな変化がオリゴの特性に大きな影響を与える可能性があるため、さまざまな目的でよく使用される修飾です。
メチル基の疎水性により、オリゴがターゲットと二重鎖を形成するときに水分子を排除するのに役立ちます。
このハイブリダイゼーション効率の向上により、いくつかの重要な利点があります。
- 5-MedC置換ごとにTmがわずかに1.3°C上昇します。
- より短いオリゴを使用できるため、プローブの消光が改善されます。
- アニーリングを妨げるターゲットの二次構造を克服するのに役立ちます。
- 特に回文配列の場合、qPCR アッセイにおけるプライマーの感度が向上します1。
治療用オリゴにおける5-MedC修飾の利点
5-MedC 修飾は、治療用オリゴの開発に広く使用されています。5-MedC は、結合特異性を高めることで、候補治療薬がオフターゲット効果を持つ可能性を潜在的に減らすことができます。重要な生化学的経路を妨げる意図しない相互作用は、潜在的な薬剤が許容できる副作用プロファイルを持つかどうかの重要な決定要因となる可能性があります。
さらに重要なことに、5-methyl deoxycytidineは、一部のオリゴに対する生体内免疫反応を防止または軽減できるため、その使用に特に関心が集まっています。
CpG モチーフ (メチル化されていないシトシンの後にグアニンが続く) は、微生物ゲノムによく見られます。つまり、私たちの免疫システムは、感染に反応するためのマーカーとして CpG モチーフを使用しています。CpG モチーフがアンチセンスオリゴヌクレオチド (ASO) に存在すると、炎症誘発性免疫反応を引き起こす可能性があり、安全な治療薬の開発の障害となります。
Henry らは、5-MedC 修飾オリゴがマウスの免疫刺激を軽減することを示しました2。これは後に、Toll 様受容体 7 および 9 の拮抗作用によるものであることが判明しました3。
この発見はすぐに臨床応用につながり、5-MedC はmipomersen (Kynamro®) に使用されました。mipomersenは 2013 年に承認され、市場に登場した史上 2 番目の ASO となりました。それ以来、5- methyl deoxycytidineは脊髄性筋萎縮症薬nusinersen (Spinraza®) を含むいくつかの成功した ASO に使用されています。
エピジェネティック制御に重要な役割を果たす5-MedC
分子生物学の研究では、5-methylcytosine (m5C または 5-mC) は豊富なエピジェネティック DNA 修飾であり、遺伝子発現を防ぐためのプロモーター領域の調節に特に重要な役割を果たしています。これはいくつかの生物学的プロセスにとって重要であり、変化は癌の発生に関連しています4。
現在、さまざまな種類の癌のメチル化バイオマーカーの in vitro 診断テストとして開発されている qPCR アッセイがいくつかあります5。これらのバイオマーカーは、診断、疾患管理、治療後のモニタリングに使用できます。
いくつかの研究プロジェクトでは、5-MedC を含むオリゴを使用して、DNA メチル化に関与するメカニズムとそれが健康に与える影響を調査しています6,7。
研究者は、5-MedC を含むメチル化オリゴヌクレオチドを、エピジェネティックな変化を誘発する潜在的な治療薬として検討しました。Yao らによってメチル化オリゴが、さまざまな癌の重要な標的であるIGF2遺伝子のプロモーターでメチル化を誘発できることが示されました8。
5-MedCを組み込んだプローブ、プライマー、カスタムオリゴを注文する
5-methyl deoxycytidineは幅広い用途があり、いくつかの成功した治療用オリゴに組み込まれてその価値が実証されています。二重鎖形成の改善、免疫反応の軽減、エピジェネティック修飾の操作能力などの利点を持つ 5-MedC 修飾は、カスタム オリゴで引き続き大きな需要があります。LGC Biosearch Technologies は、オリゴヌクレオチドの内部または 5' 末端に 5-methyl deoxycytidineを提供しています。
参考文献
- Lebedev Y et al. (1996) Oligonucleotides containing 2-aminoadenine and 5-methylcytosine are more effective as primers for PCR amplification than their nonmodified counterparts.
Genetic Analysis - Biomolecular Engineering. 13: 15-21. doi:10.1016/1050-3862(96)00139-8
- Henry S et al. (2000) Chemically modified oligonucleotides exhibit decreased immune stimulation in mice.
J Pharmacol Exp Ther 292(2):468–479. https://jpet.aspetjournals.org/content/292/2/468
- Yu D et al. (2009) Modifications incorporated in CpG motifs of oligodeoxynucleotides lead to antagonist activity of toll-like receptors 7 and 9.
J Med Chem 52(16):5108–5114. doi:10.1021/jm900730r
- Gao Y and Fang J (2021) RNA 5-methylcytosine modification and its emerging role as an epitranscriptomic mark. RNA Biol. 18(Suppl 1): 117–127. doi: 10.1080/15476286.2021.1950993
- Taryma-Leśniak O et al. (2020) Current status of development of methylation biomarkers for in vitro diagnostic IVD applications Clinical Epigenetics 12: 100. doi:10.1186/s13148-020-00886-6
- Mancini DN et al. (1999) Site-specific DNA methylation in the neurofibromatosis (NF1) promoter interferes with binding of CREB and SP1 transcription factors.
Oncogene. 18: 4108-4119. doi:10.1038/sj.onc.1202764
- Zhang H et al. (2007) Maternal cocaine administration causes an epigenetic modification of protein kinase Cepsilon gene expression in fetal rat heart.
Mol. Pharmacol. 71: 1319-1328. doi: 10.1124/mol.106.032011
- Yao X et al. (2003) A methylated oligonucleotide inhibits IGF2 expression and enhances survival in a model of hepatocellular carcinoma.
J Clin Invest. 2003 Jan 15; 111(2): 265–273. doi: 10.1172/JCI15109
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