この投稿「Know your oligo mod」では、Biosearch Technologies社を通じてカスタムオリゴヌクレオチドに組み込むことができるホスホロチオエート結合について説明します。 この修飾は、非標準塩基やクエンチャーなどの化学部分構造の追加ではなく、塩基間の特別な結合であるため、興味深いものです。 自然界に見られる標準的なDNA骨格には、塩基間のホスホジエステル結合が含まれますが、この結合は、オリゴの骨格に沿ったホスホロチオエート結合に変更できます（図1）。
図1-左側に、ホスホジエステル結合を持つ標準的なオリゴ結合の概略図を示します。オリゴの典型的な骨格を形成するリン酸結合を介して2つの5炭素糖を結合しています。右側には、ホスホロチオエート結合を示します。オリゴの塩基間のリン酸結合の酸素の1つが、硫黄原子に置き換わっています。
ホスホロチオエート結合オリゴ修飾は、非架橋酸素の1つを硫黄原子で置き換えることによってリン酸結合を変更します。この結合の変化は、実際にはオリゴの全体的な化学的性質を変化させ、分子および細胞生物学の研究用途により適したものにします。特に、ホスホロチオエート結合を追加した後の1つの結果は、ヌクレアーゼ分解に対するオリゴ骨格の安定化であり、細胞環境におけるオリゴの半減期を効果的に延長します1,2。これにより、修飾された結合はアンチセンスオリゴヌクレオチドの作成に非常に役立ちます。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞または生物学的マトリックスに導入されると、標的核酸と相互作用して特定の転写産物の発現を抑制します。ホスホロチオエート結合を含むオリゴは、翻訳を直接ブロックするか、通常はRNase Hを介したメカニズムによって標的転写産物の酵素分解を可能にすることで、この偉業を達成します3。
これらの特殊な結合は、無差別なヌクレアーゼ消化に対する安定性をもたらしますが、これらの結合を繰り返し導入すると、アンチセンスオリゴヌクレオチドとしての機能に制限が生じる可能性もあります。 オリゴに導入された各ホスホロチオエート結合は、「Sp」または「Rp」コンフォメーションとして指定される各結合にキラル中心を作成します。 これは最終的に、合成中に生成されるオリゴの複数の異性体につながります4。 これらの個々の異性体は、異なる特性と機能特性を持っていることが示されています。 幸いなことに、アンチセンスオリゴに対する異性体の影響の多くは、修飾を注意深く配置するか、ホスホロチオエート結合と組み合わせて追加の修飾を使用することで軽減されます。 非ラセミ混合物に関する懸念が大幅に減少します5,6,7。
最終的に、ホスホロチオエート結合を使用したオリゴの設計*は、修飾された結合の取り込みの効果が予測できない可能性があるため、望ましい結果を達成するためにかなりの試行錯誤が必要になる可能性があります8。ただし、これらのオリゴの作成に関する一般的な推奨事項がいくつかあり、設計プロセスで考慮する必要があります。エキソヌクレアーゼに対する保護を必要とするオリゴの場合、オリゴの5'および3'末端の近くにホスホロチオエート結合を組み込むことが示されています。
ただし、エンドヌクレアーゼに対する保護のために、これらの結合をオリゴ配列全体に含めることをお勧めします。いずれの場合も、ホスホロチオエート結合修飾をオリゴのすべての利用可能な位置に組み込むべきではないことを理解することが重要です。むしろ、それらは慎重に使用する必要があり、各結合が上記のキラリティーの問題に寄与する可能性がある影響を慎重に考慮し、またこの結合がオリゴ混成速度論にわずかに不安定な影響を与えるためです。オリゴのホスホロチオエート結合の数を増やすと、目的のターゲットのオリゴの融解温度（Tm）が低下する傾向があります。したがって、これらのオリゴを設計する場合、目的のヌクレアーゼ耐性特性は、標的配列への効果的かつ特異的なハイブリダイゼーションの必要性のバランスを慎重にとる必要があります。
Biosearch Technologies社は、カスタムオリゴサービスを通じて、ホスホロチオエート結合を組み込んだオリゴの合成を提供しています。 この変更の標準表記は、注文フォームで、[*]のようにベース間の括弧で囲まれたアスタリスクとして指定されています。 たとえば、3つのホスホロチオエート結合を含むACTGACTGのオリゴ配列は、注文プロセス中に次のように表記されます：A [*] CTG [*] ACT[*]G。
※Biosearch社は現在（2015年）、アンチセンスオリゴの設計サービスやその使用に関する特定のガイダンスを提供していません。むしろ、これらの特殊修飾オリゴのカスタム合成と精製を提供しています。
参考文献
- Effect of deoxynucleoside phosphorothioates incorporated in DNA on cleavage by restriction enzymes. Vosberg, H. P., and F. Eckstein. Journal of Biological Chemistry 257.11 (1982): 6595-6599.
- Antisense research and applications. Crooke, Stanley T., and Bernard Lebleu. CRC Press, 1993.
- Antisense technologies. Kurreck, Jens. European Journal of Biochemistry270.8 (2003): 1628-1644.
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- Stability of Stereoregular Oligo (nucleoside Phosphorothioate) s in Human Plasma: Diastereoselectivity of Plasma 3‵-Exonuclease. Koziolkiewicz, Maria, et al. Antisense and Nucleic Acid Drug Development 7.1 (1997): 43-48.
- Stereodifferentiation—the effect of P chirality of oligo (nucleoside phosphorothioates) on the activity of bacterial RNase H. Koziolkiewicz, Maria, et al. Nucleic acids research 23.24 (1995): 5000-5005.
- Synthesis, biophysical properties and biological activity of second generation antisense oligonucleotides containing chiral phosphorothioate linkages. Wan, W. Brad, et al. Nucleic acids research (2014): gku1115. doi: 10.1093/nar/gku1115.
- Antisense oligonucleotides: from design to therapeutic application. Chan, Jasmine HP, Shuhui Lim, and W. S. Wong. Clinical and experimental pharmacology and physiology 33.5‐6 (2006): 533-540.
