Know your oligo mod: ATTO dyes

この「Know Your Oligo Mod」ブログシリーズでは、オリゴヌクレオチドを標識するための高性能蛍光色素であるATTOの利点を探ります。

ATTO蛍光色素は、生物学的イメージングや分析用の蛍光標識として広く使用されている有機合成分子の一群です。これらはドイツのATTO-Tec GmbHによって開発され、同じ波長の他の蛍光色素に比べて高い光安定性と輝度で知られています。

オリゴヌクレオチドの蛍光標識は、リアルタイムPCR、DNAシークエンシング、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)、遺伝子発現解析(mRNA解析)など、分子生物学的手法におけるプローブやプライマーとして数多くの用途があります。ATTO色素は、その優れた性能と汎用性で特に注目されています。オリゴヌクレオチドのラベリングに最適なATTO色素のユニークな特性をご覧ください。

ATTO色素の特徴は？
ATTO色素は、高い蛍光性、量子収率、強い吸収、熱安定性および光安定性の向上を特徴としています。これらの有益な特性は、そのユニークな分子構造によるものです。

柔軟な構造を持つシアニンなどの一般的な色素とは異なり、ATTO色素は非常に剛直な発色団を特徴とします(図1)。この剛直な構造により、溶液中での異性体の形成が防止され、一貫した光学特性が保証されます。他の多くの色素は光学特性にばらつきが生じやすいですが、ATTO色素は溶媒や温度にほとんど依存せずに機能します。また多くのATTO色素は、大きなストークスシフト、高い耐オゾン性、良好な水溶性などの付加的な特性も有しています¹。

図1：ATTO色素の分子構造。ほとんどのATTO色素はcoumarinクマリン、acridineアクリジン、
　　  rhodamineローダミン、carbopyroninカルボピロニン、oxazineオキサジンの誘導体です。

ATTO色素の利点
ATTO色素は、紫外域の350 nmから近赤外域の750 nmまでの広いスペクトル範囲をカバーし、最も頻繁に使用される励起光源に適合する色素を含んでいます。その幅広い励起シグナル最大範囲と良好なストークスシフト分離により、ほとんどの技術に適しており、また多重化も可能です。
ATTO色素の利点は以下の通りです：

1. バックグラウンド/ノイズの低減： 多くのATTO色素は、600nmを超える波長で励起することができます。これらの長波長活性化ATTO色素を適切な励起波長で使用することにより、自家蛍光や、レイリー散乱およびラマン散乱によるバックグラウンド蛍光を減少させることができ、生物学的分析およびイメージング技術における感度を向上させることができます。
2. 高い光安定性： ATTO-ラベルは、長時間の照射下でも安定性が向上するように設計されています。ATTO 655およびATTO 647Nは、オゾン劣化にも耐性があります。さらに、ほとんどの色素は親水性であるため、水溶液中でのラベリングに非常に適しています。
3. シグナル検出の向上： ATTO色素は、カルボシアニン色素や多くの固有の自家蛍光性生体分子と比較して、0.6～4.1 nsの長い蛍光シグナル寿命を有します。これにより、パルスレーザー励起と時間ゲート検出システムを用いた、より明確で正確なシグナル測定が可能になり、寿命の短い蛍光色素やバックグラウンドの自家蛍光、レイリー散乱やラマン散乱による干渉が減少します。
4. マルチプレキシング能力： ATTO色素は、そのほとんどが100,000を超えるモル吸光率を持ち、強い蛍光シグナルを発するため、可視および近赤外発光波長を用いたマルチプレックス技術に適しています。さらに、励起／発光のオーバーラップが少ないため、マルチプレックスへの適性がさらに高まります。

オリゴヌクレオチドのATTO修飾
ATTO色素は、DNAやRNAオリゴヌクレオチドの標識に広く使用されており、診断アッセイや医薬品開発におけるハイスループットスクリーニングアプリケーションに使用することができます。赤色スペクトル領域のATTO色素は、細胞損傷を最小限に抑えることが知られており²、mRNA発現のリアルタイム可視化など、生細胞実験での使用に適しています³。

LGC Biosearch Technologiesは、オリゴヌクレオチドの5′、内部、および3′ATTO修飾を提供しています。全ての色素は高い蛍光収率を示し、光安定性が重要な実験において、一般的な蛍光色素の良い代替となります。

以下のATTOラベルのセレクションから、あなたのオリゴ、プローブ、プライマーにぴったりのものを見つけてください。カスタムオリゴのご注文ページもご覧ください。

用語集

蛍光量子収率
蛍光分子の明るさは、消光係数(与えられた波長で吸収される光の量)と量子収率(放出される光子と吸収される光子の比で与えられる)の尺度である。従って、蛍光量子収率が高いほど、蛍光体は明るくなる。

ストークスシフト
蛍光体の吸収ピークと発光ピークの差。ストークスシフトが大きいほど、自己消光が減少し、S/N比が向上する。また、インナーフィルター効果を最小限に抑えることができ、マルチカラーイメージングに有利である⁵。

光安定性
光安定性とは、光や酸素のような反応性種に曝されたときの損傷に対する耐性である。フルオロフォアの三重項状態は白化の原因となるため、酸化感受性を低下させる分子修飾によって光安定性を向上させることができる⁶。

レイリー散乱とラマン散乱
生体分子や蛍光体を含む物質と光の相互作用として記述される。レイリー散乱は波長を変えずに光を全方向に散乱させるが、ラマン散乱は波長を変化させる。どちらもバックグラウンドシグナルを引き起こしたり、蛍光体の励起や発光に影響を与えたりすることで、生物学実験における蛍光測定を妨害する可能性がある。


参考文献

1. Atto-tec.com.https://www.atto-tec.com/images/ATTO/Katalog_Preisliste/Katalog_2019_2020.pdf
2. Park HY, Buxbaum AR, Singer RH. Single mRNA tracking in live cells. Methods Enzymol. 2010. 472:387-406.
   doi:10.1016/S0076-6879(10)72003-6
   
3. Sauer M, Zander C, Müller R, Ullrich B, Drexhage K, Kaul S, Wolfrum J. Detection and identification of individual antigen molecules in human serum with pulsed semiconductor lasers. Applied Physics B: Lasers and Optics. 1997. 65(3):427-431. doi:10.1007/s003400050292
4. Wall KP, Dillon R, Knowles MK. Fluorescence quantum yield measurements of fluorescent proteins: a laboratory experiment for a biochemistry or molecular biophysics laboratory course.
   Biochem Mol Biol Educ. 2015. 43(1):52-59. doi:10.1002/bmb.20837
5. Santos EM, Sheng W, Esmatpour Salmani R, et al. Design of Large Stokes Shift Fluorescent Proteins Based on Excited State Proton Transfer of an Engineered Photobase. J Am Chem Soc. 2021.143(37):15091-15102.
   doi:10.1021/jacs.1c05039
6. Zheng Q, Lavis LD. Development of photostable fluorophores for molecular imaging. Curr Opin Chem Biol. 2017. 39:32-38. doi:10.1016/j.cbpa.2017.04.017
   
   
   

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