オリゴの合成と修飾

Know your oligo mod: Locked nucleic acids

プライムテック株式会社　バイオ試薬ソリューション部

ロックド核酸は、様々な方法でオリゴヌクレオチドを調整し、性能を向上させるために、ますます人気のある修飾です。Know Your Oligo Modシリーズの一環として、この修飾塩基がどのように機能し、qPCRプローブやプライマー、そして治療開発においてどのように使用されているかを見てみましょう。

ロックド核酸の紹介
CPG_CRISPR_figure_5_v3 Higher Resolutionロックド核酸は、リボース環の2ʹ-Oと4ʹ-Cを橋渡しするメチレン基を持つ修飾ヌクレオチドです1。架橋結合は、柔軟なリボース環を二重鎖で通常見られるコンフォメーションにロックし、ハイブリダイゼーション時のエントロピー損失を低減します。熱力学的に有利になることで、LNAはオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのTmを増加させます2。
他の2ʹ修飾と同様に、LNAはヌクレアーゼに対する安定性を高めます。Kurreckらは、3ʹ末端と5ʹ末端の両方に3つのLNAを導入すると、未修飾のオリゴと比較して血清中半減期が10倍になることを見出しました3。
LNAのもう一つの重要な利点は、一塩基多型や転写産物の変異体などの微妙なミスマッチの識別を向上させる能力です4-6。標準的なオリゴヌクレオチドが点変異の識別に苦労する一方で、短いLNAプローブが二重鎖を形成している場合には、一塩基のミスマッチはより大きな不安定化効果を持ちます。

ロックド核酸の利用
Scientist performing qPCR assay v23オリゴ中の各LNA置換は、二重鎖のTmを最大8 °C上昇させることができます7。MGBプローブよりも最適化するために繰り返し試験を行う必要がある一方で、LNAプローブはターゲットの識別性を向上させることができます。LNAオリゴは安定性が高く、結合力が強いため、開発者はより短いプローブを作製することができ、より特異的で、より優れた消光を得ることができます8。

LNA オリゴの利点は、高い特異性を必要とするアプリケーションに最適です。

  • RNA シーケンシングで cDNA ライブラリを構築するためのテンプレートスイッチングオリゴ9
  • マルチプレックスqPCRアッセイ（反応間の干渉を回避）
  • ATリッチシーケンスのターゲット
  • ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織などの困難なサンプル10

LNAオリゴの治療への応用
シーケンシングや分子診断以外にも、LNAはアンチセンス・オリゴヌクレオチド（ASO）のような治療的アプローチにも応用されています。これらの分子はRNAとDNAのヌクレオシドの混合物であり、相補的RNAに結合するとRNase Hを呼び寄せて標的を分解します。Patient with heart failure2
LNAオリゴは、小さいながらも重要な制御性ノンコーディングRNAであるマイクロRNAを標的とすることで注目を集めています。短い配列とmiRNA間の類似性により、miRNAは困難なターゲットとなっていますが、LNAは阻害剤を設計する際にそれを克服するのに役立ちます。
心筋梗塞、肺線維症、リンパ腫、C型肝炎の治療薬候補が開発されていますが、2024年現在、後期臨床試験に成功したものはありません。試験された化合物には次のようなものがあります：

  • MGN-1374は、miR-15ファミリーを標的とするLNA ASOで、心筋梗塞後の治療薬として前臨床段階にあります11。
  • MRG-110は、miR-92a-3pに対するLNA ASOで、心不全治療と創傷治癒の改善を目的としています。第I相試験で健常人ボランティアを対象に試験されたが、臨床開発は中止されました12,13。
  • Cobomarsen (MRG-106）は、いくつかのリンパ腫サブタイプにおけるmiR-155の活性阻害を目的としたLNAベースのオリゴです。第I相試験は終了したが、第II相試験のうち2試験が中止され、開発は中止されました13,14。
  • Miravirsenは、C型肝炎の治療薬としてmiR-122を標的とした15merのLNA修飾ASOです。これは、有効な抗ウイルス治療薬が開発された後に中止されました。
  • LNA-i-miR-221は、miR-221の13mer LNA阻害剤で、がんを対象とした第1相臨床試験が行われた15。
  • LNA-抗miR-21は、前臨床開発中のメラノーマ治療用にデザインされたmiR-21の阻害剤です16。
  • MB_1114は、自己免疫性心筋炎を治療するために、タンパク質mLDHBをコードするmRNAを阻害するLNA ASOとして前臨床開発中です17。 
  • LNA-抗miR-23bは、肝臓がんを治療するためのmiR-23bの阻害剤で、現在前臨床開発中です18。

治療薬にとって、LNAオリゴの重要な課題の一つは肝臓毒性です。しかし、この副作用を軽減するために、LNAの塩基数を変えたり、塩基を変えたり、5-hydroxycytosine、2-thiothymine、8-bromoguanineなどの核酸塩基誘導体を組み込むなど、様々な戦略が検討されてきました19,20。また、グアニジン架橋だけでなく、拘束された（Constrained）メチル架橋やエチル架橋など、さまざまな架橋基を用いることで、肝毒性の軽減が期待されています21,22。これらは、より安全なLNAベースの治療薬開発の可能性を提供します。

結論として、ロックド核酸は、プローブやmiRNA阻害剤など、高親和性オリゴヌクレオチドを開発するための多くの機会を提供しています。

ロックド核酸を用いたカスタムオリゴの注文
LGC Biosearch Technologies社では、ロックド核酸のニーズにお応えする様々な製品をご用意しております：



参考文献

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  2. You Y, Moreira BG, Behlke MA, et al. Design of LNA probes that improve mismatch discrimination. Nucleic Acids Res. 2006;34(8):e60. doi: 10.1093/nar/gkl175 
  3. Kurreck J et al. Design of antisense oligonucleotides stabilized by locked nucleic acids. Nucleic Acids Res. 2002;30:1911–1918. doi: 10.1093/nar/30.9.1911 
  4. Mouritzen P, Nielsen AT, Pfundheller HM et al. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Exper Rev Mol Diagn. 2003;3(1):27-38. doi: 10.1586/14737159.3.1.27
  5. Latorra D, Campbell K, Wolter A, Hurley JM.  Enhanced allele-specific PCR discrimination in SNP genotyping using 3ʹ locked nucleic acid (LNA) primers. Hum. Mutat. 2003; 22(1):79-85. doi: 10.1002/humu.10228 
  6. Simeonov A.  Single nucleotide polymorphism genotyping using short, fluorescently labeled locked nucleic acid (LNA) probes and fluorescence polarization detection. Nucleic Acids Res. 2002; 30(17):91e-91. doi: 10.1093/nar/gnf090 
  7. Christensen et al. Stopped-flow kinetics of locked nucleic acid (LNA)-oligonucleotide duplex formation: studies of LNA-DNA and DNA-DNA interactions. Biochemical J. 2001; 354(3):481-484. doi: 10.1042/bj3540481 
  8. Ugozzoli LA, Latorra D, Puckett R, et al. Real-time genotyping with oligonucleotide probes containing locked nucleic acids. Anal Biochem. 2004;324(1):143-152. doi: 10.1016/j.ab.2003.09.003 
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  21. Xiong H, Veedu RN, Diermeier SD Recent Advances in Oligonucleotide Therapeutics in Oncology. International Journal of Molecular Sciences, 2021; 22(7). doi:10.3390/ijms22073295 
  22. Sasaki T, Hirakawa Y, Yamairi F et al. Altered Biodistribution and Hepatic Safety Profile of a Gapmer Antisense Oligonucleotide Bearing Guanidine-Bridged Nucleic Acids. Nucleic Acid Ther. 2022;32(3):177-184. doi:10.1089/nat.2021.003
 



 

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