ブラックホールクエンチャー(BHQ)色素の革新的な応用例
イメージングや検出アッセイの開発では、発見できることの限界を押し広げるために、しばしば革新的なアプローチが必要とされます。LGC Biosearch Technologies™ は、弊社のBlack Hole Quencher™ (BHQ™) 染料ファミリーを用いて、これらの進歩の多くを実現できることを誇りに思っています。この2部構成のブログポストでは、BHQ色素のパワーを活用した、よりエキサイティングなイメージングおよび検出アプリケーションをご紹介します。
BHQ色素により、インスリンとグルコースのin vivo同時モニタリングが可能
課題
人間の身体の内部の生化学が時間とともにどのように変化し、治療介入にどのように反応するかを理解することは、人間の健康を増進し、精密医療を可能にし、治療薬開発を加速させます。しかし、複数の分析物を生理学的に適切な濃度でリアルタイムにモニターできるセンサーの開発は困難で、グルコースなど一部の分析物に限られていました。
解決策
最近の論文で、Poudineh et al.1は、糖尿病ラットモデルにおいてグルコースとインスリンをリアルタイムで同時にモニターできるマイクロ流体システムの開発を報告し、短時間作用型と遅発性インスリン製剤の薬物動態を検出・区別するのに十分な感度を有していると述べています。このシステムが非常にエキサイティングなのは、さまざまな分析物を検出するために簡単に一般化できることです。
技術的な進歩
この重要な開発を実現するために、Poudineh et.al.1は、特別に設計されたマイクロ流体チップに、インスリン測定用のビーズベースのサンドイッチELISAアッセイとグルコース測定用のビーズベースアプタマーアッセイを組み合わせました。
BHQの染料はどのように役立ったか
BHQ色素は、グルコース測定時のバックグラウンドを低く抑えるために使用されました。著者らは、Cy5蛍光体で標識したグルコース認識アプタマーをビーズに付着させ、グルコース非存在下でCy5シグナルを消光するためにBHQ色素を有する相補的なオリゴを使用しました。グルコース存在下では、BHQオリゴが移動し、Cy5シグナルを検出することができます（図1）。ビーズの蛍光シグナル強度は、生理的に適切な範囲において濃度とともに増加することが示され、分析対象物の定量が可能になりました。
図1. ビーズを用いた蛍光アッセイによる分析対象物の連続測定。
Cy5 蛍光色素で標識したグルコースアプタマーをビーズに付着させた。BHQ-2色素とハイブリダイズした相補的DNA鎖は、グルコースの存在下で変位し、消光して蛍光シグナルを発生しました。
BHQ色素は、個々のシグナル伝達タンパク質ではなく、シグナル伝達経路の活性化を検出します
課題
シグナル伝達経路は多くの細胞内プロセスに不可欠ですが、経路は複雑で重複していることが多く、個々のタンパク質成分は複数の異なる経路にまたがって共有されています。このように重複しているため、特定のシグナル伝達経路の活性化を追跡するには、しばしば複数の構成要素をモニターする必要があり、研究を複雑で手間のかかるものにしています。
解決策
Shi et al.2は、シグナル伝達経路の上流と下流の両方のコンポーネントが存在する場合にのみシグナルを発信する検出システムを開発することで、この課題に対する優れた解決策を提示しました。この概念実証論文において、彼らは、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（MnSOD）を介してアポトーシス信号が伝わり、c-Mycを通らないアポトーシス信号、および逆にc-Mycを介してMnSODを通らない信号の活性化を検出するセンサーの可能性を実証しています。
技術的な進歩
著者らは、2つの成分が存在するときにのみ信号を発するセンサー、すなわち「アンド」操作を行う論理ゲートと呼ぶべきものを作るため、センサーとして機能するY字型のDNAを作成しました（図2）。Y字の一方の枝には、上流経路分子であるMnSOD mRNAと、金ナノ粒子へのテザーを結合させるための相補的な配列が含まれていました。もう一方のYの枝には、下流経路分子であるシトクロムc（Cyt c）に対するアプタマーとCy5蛍光体が含まれていた。最後に、BHQ色素を含むDNA鎖が、Yの2つの枝を繋いでいました。
MnSOD mRNA がセンサーに結合すると、BHQ を含む DNA とアプタマーが金ナノ粒子から放出されるが、BHQ 染料の存在により Cy5 蛍光が妨げられます。Cyt cがアプタマーに結合したときのみ、BHQ色素を含むDNAが放出され、蛍光信号が得られます。
図2. Shi et.al.2によって開発された 2 成分センサー。
黄色は金ナノ粒子へのテザー、紫はMnSOD mRNA結合ドメイン、青緑はCyt cアプタマー、ピンクはBHQ色素でスパンされたDNA、赤はCy5蛍光体を示しています。葉酸は受容体介在型エンドサイトーシスにより細胞内への侵入を促進します。
BHQの染料はどのように役立ったか
BHQ色素の使用は、MnSODとCyt cの両分子が検出されるまで蛍光を消光しておくために重要でした。
BHQ色素が血液中の敗血症原因菌の高感度検出をサポート
課題
敗血症は致命的な症状を引き起こす可能性があり、しばしば他の病気と間違われ、適切な救命処置が遅れる原因となります。課題は、血液中に極めて低濃度で存在することが多い細菌性病原体を迅速に検出することです。現在の診断方法では、潜在的な細菌を培養するのに数日かかり、その間に病状が悪化する可能性があります。
解決策と技術の進歩
Fang et al.3は、膜ベースのろ過を使用して細菌から赤血球と白血球を分離する統合マイクロ流体チップと、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方を捕捉するためのマンノース結合レクチンコーティングビーズを開発しました。細菌は、オンチップ加水分解プローブqPCRテクノロジーを使用して識別されました。
BHQ色素はどのように役立ったか
加水分解プローブ技術に不可欠なBHQ色素は、クラス最高のクエンチャーであり、qPCRによる高感度検出を促進します。
ゲノム編集作物の正確な検出と定量をサポートするBHQ色素
課題
一部の国では、ゲノム編集作物を遺伝子組換え生物（GMO）と同様に規制し、自然に発生する変異体とは区別して検出することを義務付けています。従来の遺伝子組み換え作物は外来DNAを導入するのが一般的で、その存在が遺伝子組み換え作物であることを明確に示すのに対し、ゲノム編集作物にはそれがないことが課題となっています。
解決方法
Zhang et.al.4は、イネのゲノム編集によって、クロロフィリド・アオキシゲナーゼ1（CAO1）遺伝子に1～18塩基対を追加または削除したことに注目しました。彼らは、qPCRまたはddPCRの両方を用いて、これらの挿入や欠失を特異的に検出・定量するように設計された一連のプライマーとプローブのセットを作成しました。
技術的な進歩
検出の特異性を高め、標的外の配列へのオリゴのアニーリングを減らすために、従来のプローブに比べて高温での安定性を高めたロックド核酸プローブを使用しました。
BHQの染料はどのように役立ったか
いつものように、BHQ色素はqPCRやddPCRを用いた高感度な検出と定量に不可欠です。
BHQの染料は、あなたのイノベーションにどのような力を発揮するでしょうか？
これらの発表された例からわかるように、BHQ染料は幅広い革新的なアプリケーションを可能にします。私たちは、BHQ色素を用いた検出とイメージングのフロンティアを押し広げるお手伝いをすることを楽しみにしていますし、将来のブログ記事であなたのエキサイティングな進歩についてお話できることを願っています。
参考文献
- Poudineh M, Maikawa CL, Ma EY, Pan J, Mamerow D, Hang Y, Baker SW, Beirami A, Yoshikawa A, Eisenstein M, Kim S, Vučković J, Appel EA, Tom Soh H. A fluorescence sandwich immunoassay for the real-time continuous detection of glucose and insulin in live animals. Nature Biomedical Engineering. 5,(1) 53–63. https://doi.org/10.1038/s41551-020-00661-1. Published 2020. Accessed January 17, 2022.
- Shi H, Wang Y, Zheng J, Ning L, Huang Y, Sheng A, Chen T, Xiang Y, Zhu X, Li G. Dual-Responsive DNA Nanodevice for the Available Imaging of an Apoptotic Signaling Pathway in Situ. ACS Nano. 26;13(11):12840-12850. https://doi.org/10.1021/acsnano.9b05082. Published 2019. Accessed January 17, 2022.
- Fang YL, Wang CH, Chen YS, Chien CC, Kuo FC, You HL, Lee MS, Lee GB. An integrated microfluidic system for early detection of sepsis-inducing bacteria. Lab Chip.21, 113-121. https://doi.org/10.1039/D0LC00966K. Published 2021. Accessed January 17, 2022.
- Zhang H, Li J, Zhao S, Yan X, Si N, Gao H, Li Y, Zhai S, Xiao F, Wu G, Wu Y. An Editing-Site-Specific PCR Method for Detection and Quantification of CAO1-Edited Rice. Foods.10(6), 1209. https://doi.org/10.3390/foods10061209. Published 2021. Accessed January 17, 2022.
