非蛍光クエンチャー BHQ(Black Hole Quencher)
今回は、LGC Biosearch Technologies社が独自に開発したオリゴヌクレオチド修飾用の非蛍光性クエンチャー発色団の基礎について説明します。Black Hole Quencher™（BHQ™）色素は、しばしば単にBHQ色素と略されます。最も効果的な可視スペクトルの範囲に従い、0から3までの番号が付けられています。全ての異なるBHQ色素修飾を調べる前に、クエンチャーとは何か、オリゴヌクレオチド修飾としてどのように使用されるかについて少し説明します。
FRETクエンチング （FRET quenching）
一般にクエンチャーとは、蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescence Resonance Energy Transfer）、つまり単にFRETとして知られるメカニズムによって蛍光発光強度を抑制する能力を持つ分子の一種です。簡単に説明すると、このプロセスでは、レポーター色素（ドナー）の発光スペクトルが、クエンチャー色素（アクセプター）の吸光度スペクトルと十分なスペクトルの重なりを持つ必要があります。FRETはまた、2つの分子が空間的に近接した状態を保ちながら、正しい相対配向にあることも必要です。これらの条件が満たされると、FRETメカニズムによる励起されたレポーター色素からクエンチャーへのエネルギー移動により、2つの色素間で発光や吸収が起こることなく、非放射的な手段でレポーター色素が基底状態に戻ります。同時に、双極子結合(dipole coupling)を介して、アクセプターの吸収エネルギーがクエンチャーを励起状態に上昇させます。クエンチャーは、ドナー色素から伝達されたエネルギーに比例して、このエネルギーを消散させます。 クエンチャーがテトラメチルローダミン（TAMRA）のような別の蛍光体である場合、アクセプター色素からの発光が生じるのが一般的です。BHQ色素は、「ダーククエンチャー 」として知られるクエンチャー色素の特別なクラスのメンバーであるため、そのクエンチング能力はさらに区別されます。これらの色素は可視スペクトルに広い吸収域を持ちますが、TAMRAのような非ダーククエンチャーとは対照的に、それ自身はネイティブな蛍光を持ちません。これが、4種のBlack Hole Quencher色素が、バックグラウンド蛍光に寄与することなく、幅広い蛍光色素からのシグナルを抑制する能力の秘密の一部であり、高度に多重化された核酸アッセイを可能にします。
FRETクエンチングのメカニズムは、空間的に近接し、レポーターの発光とクエンチャーの吸光度のスペクトル特性が重なることに依存します。近接した場合、典型的には互いに10ナノメートル以内の距離にある場合、電子的相互作用が生じ、レポーター色素からクエンチャーへエネルギーが移動し、移動したエネルギーがクエンチャーを介して散逸します。クエンチャーがBHQのようなダーククエンチャーである場合、エネルギーは光子放出を引き起こすのではなく、クエンチャーが基底状態に緩和する際に、クエンチャーから熱の形で部分的に放出されます。より簡単に言えば、FRETのメカニズムを介したBHQクエンチは、励起されたレポーター色素のエネルギーを受け取り、光の放出を抑制しながらレポーター色素が基底状態に戻るように変換します。
静的クエンチング（静的消光、Static quenching)
BHQ色素は、よりよく知られたFRETクエンチングメカニズムに関与する一方で、2002年1-3年の一連の研究で解明された、静的（接触）クエンチングメカニズムによっても効率的に作用することができます。これら2つのクエンチングメカニズムの背後にある原理は非常に複雑ですが、以下のウェブページと以下に引用する文献に詳しく説明されています。第二のクエンチングメカニズムは接触クエンチング（接触消光）と呼ばれ、静的クエンチングとも呼ばれます。このメカニズムでは、蛍光体とクエンチャーが物理的に相互作用して分子内二量体を形成します。この2つの発色団の二量体化により、本質的に新しい非蛍光性化合物が生成されます。静的クエンチングは、色素とクエンチャーの親和性に依存します。BHQ色素や多くの蛍光色素は平面疎水性分子であるため、水溶液中でしばしば強く会合し、分子内二量体の生成を助けます。いずれのクエンチングメカニズムの場合も、蛍光体とクエンチャーの両方の局所濃度を高くする必要があります。そのため、クエンチングメカニズムは通常、フリーの発色団モノマーとしては有効ではなく、二重標識BHQプローブの場合のように、レポーター色素とクエンチャーを同一分子に連結することによって、互いに密接に結びつけなければなりません。Black Hole Quencher色素は、クエンチングの両方のメカニズムで作動する能力を持ち、BHQ結合オリゴがレポーター色素からのシグナルを効果的に遮断することを可能にします。
適切な非蛍光クエンチャーの選択
適切なBHQ色素を選択する際の重要な考慮点の一つは、蛍光レポーターと最も適合する吸収範囲を持つクエンチャーを確実に選択することです。BHQ-3クエンチャーが最適なスペクトルオーバーラップを提供するように見えても、当社のQuasar® 670およびQuasar 705色素をBHQ-2クエンチャーと組み合わせるなど、静的クエンチングメカニズムに特に適した色素-クエンチャーのペアリングに関する追加の推奨事項がいくつかあります。したがって、特定の色素には、複数の効果的なクエンチャーオプションがある可能性があります。 どの非蛍光性クエンチャーを選択すべきか迷った場合は、Dye Selection ChartとSpectral Overlay Toolでこれらの決定を支援する便利なツールを提供しています。また、弊社のテクニカルサービスチーム（reagents@primetech.co.jp）にお問い合わせください。
カスタムオリゴヌクレオチドに利用可能なBlack Hole Quencher修飾
| Dye | Effective quenching range |
5’ Mod. | 3’ Mod. | Internal mod. |
| BHQ-0 | 430-520 nm | ✔ | ✔ | |
| BHQ-1 | 480-580 nm | ✔ | ✔ | ✔ |
| T(BHQ-1) | 480-580 nm | ✔ | ✔ | |
| BHQ-2 | 559-670 nm | ✔ | ✔ | ✔ |
| T(BHQ-2) | 559-670 nm | ✔ | ✔ | |
| BHQ-3 | 620-730 nm | ✔ | ✔ | ✔ |
オリゴのBHQ修飾は、二重標識BHQプローブやBHQplus®プローブなど、qPCRを含む分子アッセイ用の一般的なプローブフォーマットで使用できます。これらの修飾はまた、当社のカスタムオリゴ合成サービスを通じて利用可能な、よりエキゾチックなアレンジメントの数々にも使用されています。このような幅広い用途とオリゴ構築に対応するため、LGC Biosearchは、クエンチャーの位置が異なる複数のバージョンのBHQ色素修飾を提供しています（上表参照）。すべてのBHQ色素は、オリゴヌクレオチドの末端5'および3'修飾として利用可能です。その多くは内部BHQ修飾としても利用可能で、2つのバージョンがあります。標準的な内部BHQ修飾は、オリゴの糖-リン酸骨格を介した脱塩基（abasic）結合を組み込んでいます。このバージョンの内部BHQは、修飾の両側にある標準的な塩基結合の間に位置するため、ハイブリダイゼーション時にオリゴヌクレオチドの形状に影響を与える可能性があります。オリゴヌクレオチド骨格の連続性を可能にするために、クエンチャーがデオキシチミジン（dT）ヌクレオシドに結合している内部修飾のバージョンT（BHQ）もあります。これにより、クエンチャーが塩基から外れることでハイブリダイゼーションが阻害される可能性を最小限に抑えることができます。BHQ-1の非塩基性修飾とT-結合修飾の構造を、比較のポイントとしてここに並べて示します。
Internal BHQ-1 Modification // [BHQ-1]
Internal Thymidine linked BHQ-1 Modification // [T(BHQ-1)]
利用可能なBlack Hole Quencher色素と修飾配列の数は、あなたのオリゴのための大規模なカスタマイズオプションを提示します。BHQ色素ラインの静的およびFRETクエンチングメカニズムは、可視スペクトル全域にわたって効果的なクエンチングを提供します。BHQ色素とクエンチャー進化の歴史についての詳細は、クエンチングメカニズムのアプリケーションページとqPCR Design LabのqPCR & BHQページをご覧ください。
参考文献
- Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes. Salvatore A. E. Marras, Fred Russell Kramer and Sanjay Tyagi. Nucleic Acids Research. 2002. 30. e122.
- Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes.
Mary Katherine Johansson, Henk Fidder, Daren Dick and Ronald M. Cook. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 6950. - Choosing Reporter-Quencher Pairs for Efficient Quenching Through Formation of Intramolecular Dimers. Mary Katherine Johansson. Methods Mol Biol. 2006, 335, 17.
