オリゴの合成と修飾

オリゴヌクレオチド合成の基本 その３：合成後処理の重要なポイント

プライムテック株式会社　バイオ試薬ソリューション部

今回は、オリゴヌクレオチド合成のベストプラクティスに関する3部構成の教育シリーズの最後のブログ記事です。

自動化されたホスホロアミダイト化学によってオリゴヌクレオチドを合成した後、最終用途の生物学的活性を得るために合成後の処理が必要です。固体担体からの切断、脱保護、精製という3つの主要なステップがあります。

 

切断と脱保護

合成サイクル終了後、固体担体に結合したオリゴヌクレオチドは、次の保護基で完全に保護されています。

  • 5'-末端の5'-ヒドロキシ基上の4,4'-ジメトキシトリチル(DMTr)基
  • リン酸またはホスホロチオエート基上の2-シアノエチル基
  • すべての核酸塩基（TおよびUを除く）の環外アミノ基上のアシル保護基1

オリゴヌクレオチドを下流のアプリケーションに適用するためには、固体担体から切断し、保護基を除去する必要があります。必要であれば、切断と脱保護を同時に行うことができます。

切断工程では、固体担体から全長オリゴヌクレオチドを除去します。切断処理は、通常、濃縮水酸化アンモニウム溶液を用いて室温で行われます。この処理では、オリゴヌクレオチドを固体担体から除去するだけでなく、シアノエチル基を除去して糖-リン酸骨格を脱保護し、複素環塩基から保護基を除去して一本鎖の核酸を得ることができます2。

 

脱保護戦略の考慮点

具体的な切断や脱保護の条件は、保護基や構造上の修飾により、それぞれのオリゴヌクレオチドで異なります。最も効果的な脱保護プロトコルを決定するためには、オリゴヌクレオチドの構成要素を十分に検討することが必要です。一般的には、脱保護溶液またはガス状アンモニア中で固体担体を加熱することにより脱保護が行われます。

 残念ながら、オリゴヌクレオチド合成に用いられる多くの修飾剤や標識は、脱保護によく用いられる強アルカリ条件下での長時間の曝露に耐えられません。UltraMILDモノマーであるphenoxyacetyl (Pac)-dA、acetyl (Ac)-dC、iso-propylphenoxyacetyl (iPr-Pac)-dGは、オリゴヌクレオチドに敏感な標識やタグを組み込むために穏やかな脱保護条件で合成できるようにと開発されたものです。

これらのモノマーは、メタノール溶液中の0.05 M炭酸カリウム・室温で脱保護することができます。UltraMILDモノマーは水酸化アンモニウム水溶液でも脱保護が可能です。実際、アセチルはすべての脱保護条件に適合するため、dCの保護基として選択されています。

 

以下は、脱保護の戦略を立てる際に考慮すべきいくつかの質問です。

  • 穏やかな脱保護を必要とする修飾があるか？
  • 製品はどのくらいで必要になりますか？
  • オリゴヌクレオチドは精製されますか？その場合、どのように行いますか？

これらの質問に対する回答は、どの脱保護方法が最も適切かを決定するのに役立ちます。

 重要なポイント：効果的な脱保護戦略は、オリゴヌクレオチドの成分、使用する試薬、手順、温度によって異なります。

 

精製

脱保護後のオリゴヌクレオチドは、通常、逆相カートリッジ（RPC）、逆相高速液体クロマトグラフィー（RP HPLC）、陰イオン交換HPLC（AX HPLC）またはポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）により脱塩または精製されます。

適切な精製方法を選択することで、最終製品であるオリゴがその用途に適したものであることが保証されます。純度が高くなると収率が低下するため、各用途における純度と収率の適切なバランスを見出すことが非常に重要です。リソースの利用可能性、時間、および純度の要件は、どの精製方法がアプリケーションに最も適しているかを決定するのに役立ちます。

オリゴヌクレオチドの精製には、以下のプロセスが日常的に使用されています。

 

脱塩

petaluma_1_3_2脱塩したオリゴヌクレオチドは、マイクロアレイ、シーケンシング、qPCRプライマーなどの用途に適しています。オリゴは、合成、切断、脱保護の工程で生じた低分子の副生成物を除去するために処理されます。脱塩処理は、36塩基未満のオリゴヌクレオチドでは一般的に許容されます。より長い配列や繊細な用途に使用されるオリゴヌクレオチドの純度を高めるために、カートリッジやHPLC精製などのさらなる処理を推奨する場合があります。

 

 

LGC Biosearch Technologies社では、お客様のご要望に応じてオリゴを精製することが可能です。

逆相カートリッジ

非標識オリゴヌクレオチド（プライマー）の場合、 RPCは優れた選択肢となります。この方法が効果的であるためには、オリゴヌクレオチドの最終塩基にDMT保護基（「trityl-on」）が含まれている必要があります。疎水的にタグ付けされた完全長「trityl-on」オリゴヌクレオチドは、トリチル基がなく、カートリッジの樹脂疎水性マトリックスに効率的に結合しない失敗配列と容易に分離することができます4。精製したオリゴはカートリッジから溶出し、DMTが除去されます。RPC精製は、50塩基以下のオリゴの完全長生成物を濃縮するのに適しています。より長いオリゴヌクレオチドについては、HPLCまたはPAGE精製を推奨します。

 

逆相HPLC

RP HPLCは、色素を含むオリゴの精製によく使用され、プローブ合成時に残った蛍光性の不純物を除去することができます。この不純物は、バックグラウンドの蛍光を上昇させ、シグナルの検出を不明瞭にする可能性があります。また、RP HPLCは50塩基以下のオリゴヌクレオチドの大量合成に最適なオプションです。長いオリゴヌクレオチドもこの方法で精製できますが、純度や収率に悪影響が出る可能性があります。RP HPLCでは、オリゴの複雑さにもよりますが、通常、純度80%程度の製品が得られます。この精製方法の原理はRPCと似ていますが、使用する樹脂によってより多くのサンプル容量を確保することができます。

 

アニオン交換HPLC

AX HPLCは、オリゴヌクレオチドが重要な二次構造を持つ場合、RP HPLCの代替として使用されることが多く、GC含量の高い配列によく見られます。AX HPLCは、プローブ製造を悩ませるクエンチャーだけの失敗配列のような、合成時のカップリング不良から生じる切断された(Truncated)オリゴを除去します。この不純物が残っていると、標的配列を見つけるためにプローブと競合し、qPCRアッセイにおいて閾値までのサイクルを遅らせる可能性があります3。AX HPLCは少量のオリゴヌクレオチドの精製に最適ですが、最大の効果を得るためには、オリゴヌクレオチドの長さを約40塩基に制限する必要があります。

 

デュアルHPLC

デュアルHPLC精製は、AX HPLCの後にRP HPLCを行う方法です。この方法は、他の方法よりも厳密な精製方法であり、オリゴの複雑さにもよりますが、通常、約90%の純度の製品を得ることができます。工業用途のqPCRアッセイに使用されるオリゴや蛍光プローブなどの修飾を含むオリゴなど、高い純度が要求される場合に優れた選択肢となります3。

 

変性PAGE

PAGE精製法は、電荷の代わりに分子量を用いてオリゴヌクレオチドから不純物を分離する方法です。全長のオリゴヌクレオチドを高い確率で得ることができ、50塩基以上の未修飾配列を精製することが理想的です。他の精製方法と比較して高い純度が得られますが、PAGEで精製されたオリゴの最終収率は、HPLC法で精製されたオリゴよりも低くなります。オリゴの複雑さにもよりますが、PAGEでは通常95%以上の全長配列の純度を達成することができます。また、修飾オリゴは疎水性であるため、PAGEではHPLCほど効果的に分離できないという制約があります。

 

精製と最終収率

精製方法が厳密であればあるほど、最終的な収量は減少します。そのため、塩を含まないオリゴは、収量は最も高いものの、一般的に純度は最も低くなります。一方、HPLCとPAGEを併用する方法では、純度は最も高くなりますが、収量は他の方法と比較して低くなります。

重要なポイント：オリゴヌクレオチドの純度を上げるにはいくつかの方法がありますが、適切な選択はその使用目的と構造によって異なります。

合成後の処理は、最終アプリケーションの純度および収率の要件を満たす活性オリゴヌクレオチドを開発する上で重要なステップです。当社のテクニカルサポートチームは、適切な脱保護および精製方法の選択を支援し、社内での合成後処理に適した製品を推奨します。

 

参考文献

  1. Gibson, W and Koch C. Biotechnology and Genetic Engineering. Ed-Tech Press. Published 2019.
  2. Ellington, A and Pollard, JD Jr. Introduction to the synthesis and purification of oligonucleotides. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 3C.1-A.3C.22. John Wiley & Sons Inc. Published 2000. https://deepblue.lib.umich.edu/bitstream/handle/2027.42/143751/cpnca03c.pdf?sequence=1
  3. Oligo purification. LGC Biosearch Technologies. Accessed August 17, 2021. https://www.biosearchtech.com/support/resources/oligo-purificatio
  4. Pollard, J.Synthesis of Oligonucleotides. Department of Molecular Biology - Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School protocols.Published 1998. Accessed August 20, 2021. https://molbio.mgh.harvard.edu/szostakweb/protocols/oligo/index.htm

 

 

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